Extração de DNA utilizando a resina Instagene Matrix® como ferramenta para otimização do diagnóstico molecular de leishmaniose visceral canina (LVC) em Mato Grosso do Sul, Brasil.
Resumo
Mato Grosso do Sul é considerada área endêmica para as leishmanioses e no ambiente urbano o principal reservatório da leishmaniose visceral é o cão. Parte das ações de controle dessa doença é a eutanásia de todos os animais com diagnóstico positivo. Este trabalho utiliza a resina Instagene Matrix® como forma alternativa de extração de DNA para diagnóstico molecular da LVC em esfregaço de medula óssea e fluído peritoneal de cão, salientando a alta eficiência, custo-benefício e agilidade da técnica. As duas amostras utilizadas no trabalho foram cedidas: uma pelo Hospital Veterinário da Uniderp e a outra do laboratório Diagnovet. Ambas as amostras foram coletadas de cães SRD (sem raça definida) adultos, diagnosticados com poucos sinais clínicos de leishmaniose visceral. A extração de DNA com a resina seguiu as indicações do fabricante. Foi recolhido 200 mL da amostra fluida, e no esfregaço em lâmina raspou-se o conteúdo do esfregaço utilizando uma lâmina de bisturi estéril, o conteúdo recolhido foi adicionado a um microtubo de 1,5 mL e em seguida adicionou-se 500 µl de água para PCR. Então incubou-se as amostras a temperatura ambiente por 30 minutos e logo após centrifugou-as por 3 minutos à 12,000 rpm. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado 200 µl da resina Instagene Matrix®, novamente incubou-se as amostras por 30 minutos a 56ºC. As amostras foram homogeneizadas em vortex por 10 segundos e incubadas pela última vez por 8 minutos a 100 ºC. As amostras foram homogeneizadas novamente em vortex por 10 segundos e centrifugadas por mais 3 minutos a 12,000 rpm. O sobrenadante (50µl a 200µl) foi recolhido e foi utilizado para os testes moleculares. As amostras foram dosadas no Qubit® e ambas apresentaram grande quantidade de DNA (acima de 100 ng/µl) comprovando a eficiência da técnica de extração. As duas amostras foram testadas pela PCR dirigida ao gene ITS1 de Leishmania spp. e ambas se mostraram positivas. A extração de DNA utilizando a resina Instagene Matrix® se mostrou altamente eficiente, de fácil manipulação e rápida execução na obtenção do DNA de qualidade de amostras biológicas de cães diagnosticados clinicamente com LVC.
Palavras-Chave: Instagene, LVC, PCR.
Apoio: Anahnguera-Uniderp, Fiocruz, CNPq, CAPES, FUNDECT.Ao publicar na PECIBES, os direitos de copyright são mantidos pelos autores. Acreditamos que isto permite aos autores ampla divulgação do trabalho, sendo os mesmos responsáveis por todas as informações veiculadas. No entanto, em caso de reuso dos dados, a origem (Revista PECIBES) deve ser citada.
